最終診斷 772.反向輸出
測試廣告1
?在診斷時，20–30的患者患有同步肝轉移（l），所有crc患者中的50–75會發生肝轉移，這是導致死亡的主要原因。為了提高os，我們需要進一步了解 crc 並確定其他治療靶點。雖然臨床前研究集中在原發腫瘤（pu）和轉移過程，但臨床挑戰在於轉移患者的最佳治療。此外，沒有常用的免疫活性動物模型重現 crc pu 和轉移的生長，使得我們對於了解轉移性 crc 充滿挑戰。
?腫瘤細胞在複雜的微環境中生長，涉及驅動腫瘤生長、侵襲和轉移的細胞外和細胞內信號。組織力學特性的變化既可以先於疾病發展，也可以推動疾病發展，腫瘤「硬度」與幾種腫瘤類型的預後相關。先前的研究表明，包括乳腺癌和胰腺導管腺癌在內的幾種實體瘤的疾病進展與其彈性模量相關。
?組織剛度是組織抵抗變形的程度，由應力和應變之間的關係描述。在組織水平上，剛度受細胞骨架和細胞外基質（e）的控制。纖維狀膠原蛋白是最豐富的 e 支架蛋白，對組織剛度有顯著影響。富含膠原蛋白i（l-i）的異常 e 重構已被確定為癌症進展過程中組織硬化的主要原因。作為 e 的主要來源，癌相關成纖維細胞（caf）通過表達賴氨醯氧化酶（lo）來進一步改變腫瘤機械環境，賴氨醯氧化酶是一種胺氧化酶，可啟動膠原蛋白的共價內和分子間交聯過程。在實驗模型中，通過 lo 抑制來抑制基質硬化可改善腫瘤生長並改善治療。因此，caf 被認為是限制癌症進展的有希望的治療靶點。
?腫瘤微環境在為腫瘤提供血液供應方面也起著關鍵作用。通過使用單克隆抗體、vegf 陷阱或多靶點酪氨酸激酶抑制劑靶向血管內皮生長因子（vegf）信號通路來抑制 crc 血管生成。目前，療效不足和耐藥性限制了抗血管生成療法的益處。此外，內皮細胞（ec）根據機械環境調節其屏障能力和生長。具體而言，堅硬的基質促進 ec 增殖並可能導致血管完整性缺陷，這表明機械環境可能會影響腫瘤中的 ec 行為，從而影響抗 vegf 的功效本研究旨在闡明轉移性血管生成是否受機械微環境的影響，機械微環境可以通過 crc 中轉移相關的成纖維細胞（af）激活進行調節，以及是否可以改變這種 af 激活以提高抗血管生成治療的療效。
1、crc中的 af 高度激活
?在l中觀察到 asa、p-lc2 和 l-i 的顯著更高表達，表明 af 的肌成纖維細胞和 e 重塑特徵。
?接下來，從 crc 患者的 pu(caf)和 l(af)中分離出原代成纖維細胞。af 顯示出 asa 和 p-lc2 的顯著上調，證實了肌成纖維細胞和細胞收縮性信號的增加。fas 的量化顯示 afs 中 fas 的平均面積更大（圖l和），支持 crc afs 被高度激活。
2、晚期 crc 患者的 e 重構和硬化特徵
?為了鑑定與肝轉移相關的基因表達特徵，我們對 crc 患者的 pu 和 l 進行了 rna 測序（rna-seq）。使用通路相互作用資料庫(pid)對 l中上調基因進行的基因集分析(gsa)揭示了整合素信號傳導的顯著富集。為了進一步表徵成纖維細胞的基因表達，我們在成功富集後對分離的原代 caf 和 af進行了 rna-seq。
?我們鑑定了3，721個差異表達的基因。go確定了af中上調的肌成纖維細胞/e重塑特徵。kegg確定了e-受體相互作用和fa特徵和pid確定了整合素信號（圖h）。此外，基因集富集分析(gsea)還揭示了差異表達基因的肌動蛋白介導的細胞收縮、fa、e成分、肌生成和血管生成特徵的強烈富集（圖i-）。
3、afs增加微環境硬度，支持血管生成
?我們進行了凝膠重塑分析，並觀察到af顯示出更密集、更複雜的f-肌動蛋白網絡（圖 a），並且可以比 caf 更大程度地收縮凝膠（圖b）。在新鮮和冷凍保存的組織中，我們觀察到 l 的基質硬度顯著增加（圖c-d）。基質硬度與來自同一患者的樣本中的l-i、asa 和 p-lc2 表達相關（圖e-g）。
?基質硬化調節 ec 增殖、血管生成、血管生長和分支，為了研究這種聯繫，我們評估了 l 中的脈管系統，並觀察了基質硬度和 cd31 血管面積之間的相關性（圖h）。當在凝膠內培養時，允許成纖維細胞重塑基質，afs 誘導 ec 發芽的程度顯著高於cafs（圖i-k）。因此，af 支持伴隨局部 e 重塑的細胞因子產生血管生成。
4、腎素-血管緊張素系統抑制目標成纖維細胞
?對新鮮分離的 af 與肝源性成纖維細胞的 qpcr 分析顯示 ras 系統的所有關鍵成分（血管緊張素原[ag]、腎素[ren]、血管緊張素轉化酶[ace]和a-1[agr1]的表達顯著增加）。此外，afs 表達的 ag 和 agr1 水平顯著高於cafs（圖l-o）。為了表徵 ras 靶向對 af 功能的影響，我們在用氯沙坦（一種a-1阻滯劑）或卡托普利（一種ace抑制劑）治療後進行了凝膠收縮試驗。在低濃度（氯沙坦為1，卡托普利為5）和高濃度（氯沙坦為10，卡托普利為 50）時，兩者都顯著降低了 af 凝膠收縮（圖p-r）。
5、ras 抑制降低轉移基質硬度並重塑微環境
?與無高血壓組和非 ras 治療組2相比，接受抗 ras 藥物治療的患者組織硬度顯著降低（圖a-b）。進一步評估（通過對同一患者組中的l-1、asa 和 plc2 染色）是否可以通過 af 激活的下調來解釋轉移剛度的差異。雖然高血壓與 plc2 染色的增加相關，但我們沒有觀察到對asa 和 l-i 的影響（圖c-h）。在所有組中，抗 ras 治療顯示 af 激活和 e 沉積顯著減少（圖c-h）。抗ras藥物的作用獨立於特定的 ras 抑制治療。觀察到轉移僵硬（不同條件±高血壓±抗ras藥物）與l-i、asa和p-lc2表達之間呈正相關（圖i-k），表明af激活水平有助於組織僵硬在l。總之，接受抗 ras 治療的患者顯示出低肌成纖維細胞/e 特徵，這解釋了轉移硬化的減少。
6、a1r 信號轉導通過 rhoa 介導 af 激活
?接下來，作者想確定 ras 抑制如何導致 af 激活減少。體外用氯沙坦或卡托普利處理 af 表明 lo 和 l1a1 rna 表達降低（圖a-b）。p-lc2 在 ras 抑制後也顯著減少（圖c-d）。氯沙坦和卡托普利治療顯著降低了 arhgef1 的酪氨酸磷酸化，並導致活性 rhoa 減少（圖e-h）。類似地，arhgef1 的敲低導致 p-lc2 減少，支持血管緊張素-arhgef1-rhoa 軸在 af 中的作用（圖i-j）。總的來說，我們結果表明 ras 通路抑制劑通過抑制 af 主動收縮（圖k）以及減少膠原蛋白生成和交聯來阻止基質硬化，從而改善腫瘤纖維化過程。
7、ras 抑制增加了貝伐單抗的抗血管生成作用
?基質硬度不受單獨貝伐單抗治療的影響（圖a-b）。在 bev-組中，與非 ras 治療的高血壓患者和無高血壓患者相比，抗 ras 治療導致組織硬度降低（圖a，c）。類似地，在 bev 組中，在抗 ras 治療的患者中也觀察到了相同的基質硬度降低（所有p＜0001）（圖a，d）。此外，抗 ras 治療組的硬度降低與特定治療無關。單獨的貝伐單抗治療不影響 l 內的 l-i、asa 和 p-lc2。為了評估抗血管生成治療（貝伐珠單抗治療）和ras 抑制對血管系統的綜合影響，我們測量了一大群 crc l 中的血管密度。與 bev-組相比，bev+組的血管密度顯著降低了487± 82。然而，與非ras、bev+治療相比以及與所有 bev-組。這與使用的 ras 治療類型無關。因此，抗 ras 藥物靶向組織硬度，從而影響貝伐單抗的療效。
8、通過 ras 和血管生成抑制減少 ec 增殖
? ec 增殖隨硬度增加而增加，vegf 進一步誘導增殖，低硬度時 vegf 效應最高（圖a-c）。此外，我們分析了在不同密度的纖維蛋白原基質（剛度的代表）中存在或不存在 vegf 的情況下 ec 發芽。ec發芽（芽的數量和長度）隨密度增加。vegf 導致在所有條件下進一步發芽，vegf 在軟基質中的作用更顯著，如 ec 增殖的情況。
?為了了解抗 ras 藥物和貝伐單抗的組合如何影響轉移灶內的 ec，我們量化了它們對 ec 增殖的影響。單獨的貝伐單抗治療導致 ec 增殖減少 561±110。由於轉移僵硬與獨立於治療的轉移內的 ec 增殖相關，我們評估了 ras 抑制是否足以減少 ec 增殖。在未接受抗血管生成治療的患者中，ras 抑制並未顯著降低 ec 增殖；然而，在接受貝伐單抗和抗 ras 藥物治療的患者中，ec增殖進一步降低了 781±92）。
9、ras 和血管生成抑制改善血管完整性
?有趣的是，vegf 和基質硬化都有效地導致血管通透性。為了進一步表徵抗 ras 藥物對血管完整性的作用，我們通過對緊密連接蛋白 zo-1（封閉小帶1）進行免疫染色分析了它們對ec 連接穩定性的影響。雖然建議貝伐單抗治療導致消除未成熟血管，但我們觀察到貝伐單抗對 zo-1 緊密連接沒有變化（圖a-b）。與之前在其他疾病模型中的發現一致，即增加基質剛度可增強內皮通透性，我們還觀察到 zo-1 覆蓋率與 crc l 的組織硬度之間存在負相關，表明在更硬的 l (圖c)。在接受抗 ras 藥物治療的 bev-患者中，我們還觀察到 ec 中 zo-1 覆蓋率的增加，表明單獨的抗 ras 足以改善內皮連接穩定性（圖a，d）。然而，在聯合治療（bev+和抗 ras）中，對連接穩定性的影響大大增強（圖a，e）。
? klf2 是一種剪切應力響應轉錄因子，其表達隨層流剪切應力增加，是灌注的標誌。抗血管生成治療沒有改變內皮細胞中 klf2 的表達（圖f-g）。然而，klf2 表達與組織剛度呈負相關，表明基質硬度增加會損害灌注（圖h）。在未接受貝伐珠單抗治療的患者中，klf2 表達未因抗 ras 治療而改變（圖f-i），但在抗 ras 和貝伐單抗治療的患者中顯著更高（圖f、j）。
10、內皮細胞yap/az 是受 l 基質硬度和vegf 調節的中樞
?然後我們使用ec 核標記 erg1 分析了患者樣本中的 ec yap/az 激活狀態。抗血管生成治療導致 yap/az ec 硬度降低（圖k，l），表明 vegf 信號是 l 中 ec 中 yap/az 易位所必需的。然而，與非高血壓患者以及接受貝伐珠單抗和非 ras 藥物治療的患者相比，貝伐珠單抗治療同時停用 vegf 的同時降低僵硬度降低了核 yap/az 強度（圖k，n），與 ras 抑制的類型無關。最相關的是，我們觀察到接受 l 切除術並在疾病過程中接受抗血管生成治療並同時進行抗 ras 治療的患者的 os 顯著延長。 這通過多變量 回歸分析得到證實（圖o）。綜上所述，抗血管生成治療聯合ras抑制顯著抑制內皮 yap/az 激活和轉移性血管生成。
?研究優點
1腫瘤受到其微環境的機械特性的影響。利用患者樣本和原子力顯微鏡，我們發現肝轉移瘤的組織硬度高於原發性結直腸腫瘤。高度活化的轉移相關成纖維細胞增加了組織的硬度，從而增強了血管生成和抗血管生成治療的抵抗力。
2針對腎素-血管緊張素系統的藥物通常用於治療高血壓，可抑制成纖維細胞收縮和細胞外基質沉積，從而減少肝轉移瘤硬化，並增加貝伐單抗的抗血管生成作用。
3接受貝伐單抗治療的患者在同時接受腎素-血管緊張素抑制劑治療時存活時間延長，這突顯了調節治療方案的機械微環境的重要性。
?研究局限性
1對於接受貝伐單抗治療的結直腸癌和肺癌患者，貝伐單抗治療本身就能誘發高血壓。在該研究中並未對與貝伐單抗無關的高血壓及貝伐單抗導致的高血壓進行區分。
772.反向輸出
