最終診斷 774.敵人的敵人就是朋友
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790+和790?疾病狀態的基因組圖譜
我們首先評估了我們隊列中的體細胞基因組改變（除egfr790外）與38例晚期egfr突變非小細胞肺癌患者的治療初期隊列（es數據）的患病率差異。p53snv改變在ki耐藥人群（63）中比治療初期人群（45）更為普遍。此外，我們檢測到與治療初期腫瘤相比，治療耐藥腫瘤中er和編碼於14q22的三個基因（pgdr、sav1和sos2）的基因組擴增率總體較低。接下來，通過比較790+和790?，我們試圖確定先前報道的並確定潛在的新的治療可處理耐藥機制?抗ki的樣品。5例（8）患者出現改變，主要發生在790?患者隊列。在一名患者（a056）中，檢測到導致外顯子14跳躍（e14）的剪接位點缺失，外顯子14處的轉錄缺失通過rnaseq數據驗證。該患者還表現出染色體臂7p缺失（egfr突變缺失）和12q擴增（包含d2和cdk4，通常用e14擴增）。同樣，我們沒有在另一名790?患者中檢測到原發性外顯子19缺失/l858r突變（a058），表明失去激活egfr突變是獲得性耐藥真正罕見的機制。pik3ca突變（n=10，17）和her2擴增（n=4，7）是常見的，但基於790狀態沒有差異（分別為p=069和p=054），儘管耐藥腫瘤中pik3ca改變的頻率（17）總體上高於晚期治療未經egfr突變腫瘤的患者（5，p=009）。在pik3ca突變中，值得注意的是，大多數是克隆的（n=5/7），並且由clvar注釋為可能致病的（n=6/7）綜上所述，這表明pi3k信號在介導ki抵抗中的作用獨立於790狀態。鑑於keap1和nfe2l2共突變在產生治療抵抗中的潛在作用。然而，我們沒有在隊列中檢測到任何nfe2l2突變，我們只在790+腫瘤（a449）中檢測到一個keap1突變。
p53改變是在大約一半的egfr突變的腫瘤中發現的早期克隆事件。與790+患者相比，790?患者p53基因突變顯著豐富(86vs50，p=001)，其中大部分(n=36/37，97)為早期克隆事件(n=36/37，97)，與790+患者相比差異有顯著性(p=001)。此外，d2和yeas4擴增在790+患者中更為常見，且與p53突變互斥(p=0004)。這兩個基因位於同一染色體位置，負調控p53。正如我們和其他人以前報道的，已知的癌症驅動基因突變的數量越多，多變量分析的p越短(hr，141；95ci，109-181；p=0008；補充圖s8a)。特別是，並發的rb1/p53改變(n=5)與790狀態無關的p密切相關，與最近的一份報告一致。
拷貝數分析發現，gd是常見的，與治療初期egfr突變腫瘤中觀察到的比率(88vs89)相當。然而，在7名(12)沒有gd的患者中，所有人都是790+(嵌入圖像測試，p=004)，並且有egfr外顯子19的缺失，這表明gd的缺失預示著790+耐藥疾病的出現。在790+和790?腫瘤之間，基因組不穩定指數(gii；中位數分別為52和55)沒有差異，也沒
有發現p53共突變與gii增加相關。790?患者的腫瘤突變負荷高於790+患者(b中位數為236vs166個突變/b，p=002，圖1c；補充圖1c、s9a)，可能是由於790?隊列中的吸菸者數量較多
接下來，我們檢查了790?患者3q(包含pik3cb、ras和fol2等基因)和790+患者14q21(包含foa1和nk2-1)與790狀態揭示擴增相關的反覆焦點擴增和缺失事件(補充圖s10)。值得注意的是，3qar擴增在790?組(57)高於790+組(13)，並且是唯一有統計學意義的ar水平事件(圖1e，ebeddediage-esp≤0001)。我們證實了染色體3q基因(包括so2)在3q臂增加的患者中有較高的表達(補充圖s11c)。為了了解ki治療後這些染色體水平改變可能獲得的程度，我們再次與治療前的隊列進行了比較。在治療-初始隊列中，38例中有7例(18)出現了3q增加(補充圖s3)腫瘤。這一結果明顯低於790?(p=0003)，但與790+患者相似(p=053)，提示3q擴增可能是790?腫瘤特異獲得的。有趣的是，染色體3q含有鱗狀細胞系轉錄因子p63和so2，是肺鱗狀細胞癌的主要特徵，但以前與肺腺癌無關。
接下來，我們研究了與egfrki耐藥相關的突變過程。在肺腺癌中發現了公認的突變特徵，即衰老、apobea雙鏈斷裂修復、吸菸和dna錯配修復。與790?相比，egfr790耐藥腫瘤對衰老信號的相對貢獻率更高，這與egfr790點突變的三核苷酸背景下ag的最高概率核苷酸變化一致(補充圖3s12和s13)。相反，與790+腫瘤相比，非衰老特徵(吸菸、載脂蛋白bea修復)在790?中的比例顯著高於790+腫瘤，暗示了驅動790?抗性的另一種突變過程。總體而言，這表明790耐藥性可能不太可能出現在具有較大比例的活躍的非衰老突變特徵(例如吸菸/apobec特徵)的腫瘤中。
我們使用es數據估計了每個腫瘤樣本的癌細胞比例(純度)，並使用轉錄組去卷積方法ura估計和比較了790+和790?腫瘤中癌症和間質(非惡性)細胞中的基因表達。值得注意的是，我們推測在790?腫瘤的癌細胞中，肺腺癌標誌基因如napsa、nk2-1、sfa2和sfa3的表達普遍且幾乎完全喪失。此外，我們觀察到鱗狀細胞癌或神經內分泌癌的組織學標誌基因在一小部分790?腫瘤中的表達增加(n=4，27。這些發現得到了多重免疫熒光的正交驗證，證實了與790+腫瘤相比，790?癌細胞中napsa和nk2-1(f-1)的表達降低(圖2d；補充圖s14)。值得注意的是，對三個未接受治療的nsclc腺癌隊列的分析表明，低腺癌標誌物基因(napsa和nk2-1)的表達非常罕見，僅在egfr野生型腫瘤中觀察到(圖2f)。總而言之，這些數據突顯了ki耐藥後獲得性譜系可塑性以前被低估的程度，特別是在790?腫瘤中，與3q擴增和非衰老突變簽名過程共存，潛在地促進了表皮生長因子受體獨立的信號機制。谷
鑑於檢查點抑制劑在egfr突變的nsclc中缺乏療效，我們試圖描述與egfrki耐藥相關的免疫環境，最初根據「細胞炎症基因表達譜」(gep)特徵對腫瘤進行分層。
然後，我們使用了一種已發表的計算方法(eder；ref)進一步闡明與ki耐藥相關的浸潤免疫細胞亞群。這表明，與免疫790+腫瘤相比，免疫790?中dscs的推測水平更高(p=004，檢驗)，而a2的水平更低(p=0003，檢驗)。免疫790?中pd-l1、fop3和ido的表達也顯著高於免疫790+腫瘤(圖3b，pd-l1和fop3多重免疫熒光染色見附圖s15b和s15c)。接下來，我們調查了耐藥時的免疫表型是否與之前1g/2gki的持續時間有關。有趣的是，免疫790?腫瘤的總p最短(圖3c)，其中一半(5/10名患者
)的總p小於3個月。相反，免疫790+腫瘤的總生存期最長(中位p206個月；範圍82月至768月)，與免疫冷藏790+腫瘤相比(中位p41月；範圍13月至13月；心率1178；p=0004；95ci301月~462月；p=0001；圖3c)。a分析強調單劑免疫檢查點抑制劑在egfr突變的非小細胞肺癌(59例)、7/8(88，4/8熱、2/8冷、2/8未知)患者中缺乏療效，這與a分析一致(補充表s5)。然而，一名免疫790+患者(a096)在臨床試驗中接受了nivoab-ipiliuab免疫檢查點抑制劑的聯合治療(60例)，並獲得了89個月的穩定病情。綜上所述，我們的數據提示炎性趨化因子的潛在作用，例如，l9-可能由dscs驅動-在介導790?ki耐藥中發揮作用。此外，我們的數據突出了gep「熱」腫瘤中成分的顯著異質性，說明需要更詳細地詢問免疫環境以描繪特定的免疫靶點。
雖然第三代egfrkis越來越多地被採用在一線環境中，但這種臨床實踐在一定程度上是由於無法預測單個患者的耐藥軌跡。在確定了與不同egfrki抵抗狀態相關的新的分子特徵(3q擴增、轉錄亞型、腺癌譜系標記丟失和炎症的)後，我們試圖建立一個模型來預測790的出現。我們推測，這些基因組、染色體水平和轉錄特徵可能存在於基線水平，也可能代表在治療過程中獲得的變化(圖4a)。為了進一步探討這一點，我們確定了在1g/2gki治療開始之前可能存在的三個軀幹特徵egfr外顯子19缺失、gd缺失和p53改變(圖4a)。使用貝葉斯方法，單個患者可以根據他們治療前的分子基因型被分成不同的組，其發生egfr790耐藥的幾率非常不同(圖4b)。例如，在非gd腫瘤中，發生790耐藥性的概率在872到979之間，這可能意味著序貫治療第一代/第二代到第三代egfrki可能是這些患者(我們隊列中11的患者)可行的臨床策略。這些特徵的預測能力需要在更大的隊列中進一步驗證。然而，這些結果說明了數據驅動的治療算法是如何通過真實世界的證據得出的，並可能有助於為個別患者定義最佳的排序策略。
我們的研究首次對egfrki耐藥的基因組和轉錄圖譜進行了全面和綜合的分析。值得注意的是，我們的數據顯示，到目前為止，血統的可塑性在一定程度上被低估了。儘管在ki耐藥後有1到3的患者有組織轉化的報道，但我們發現在790?腫瘤中，腺癌標誌物(naps-a和f-1)普遍丟失，同時非ru亞型(pi和pp)明顯富集。雖然缺乏配對的基線樣本是我們研究的局限性，但與治療單純的egfr突變的非小細胞肺癌的比較表明，腺癌譜系標誌的丟失，特別是在790?疾病中，可能代表了慢性egfrki暴露導致的早期去分化事件。790?疾病更顯著的基因組改變有p53突變(86比50)、3q擴增(57比13)和改變(19比3)，這進一步導致了790?的可塑性和耐藥性。
臨床上特別感興趣的是790?隊列中的免疫熱亞群，它代表了一組患者的p明顯較短，其特徵是gep評分高，pd-l1過度表達，以及富含趨化因子的免疫抑制微環境。與我們的發現一致，回顧性分析表明pd-l1的高表達與低應答率和pfs之間的關係，提示「炎症性」介導對egfrki的原發性耐藥。 最近，抑制egfr信號被發現可以耗竭reg和增加ifnγ信號，支持「炎性」的之間的聯繫，認為這是一種適應性變化，可能會削弱對靶向治療的反應。我們的數據進一步表明，炎性的可能發生在原發或繼發耐藥時，並由cd8+細胞(腫瘤抗原特異性和/或旁觀者)、reg和dsc可變地組成。最後，觀察到ido1的高表達，特別是在790?免疫熱腫瘤中，伴隨犬尿氨酸的過度表達(kynu；圖2b)，暗示ido途徑在維持reg激活和在腫瘤亞群中的免疫抑制環境中起作用。最近，通過對一系列癌基因驅動的非小細胞肺癌腫瘤的單細胞rna-seq，aynard和他的同事同樣強調了ido途徑、免疫微環境和肺泡再生細胞特徵在靶向治療中的重要性。我們的數據擴展了這些觀察，說明了治療誘導的適應性細胞
狀態可能會受到基因組改變的影響，並表明癌細胞、免疫細胞群和趨化因子中egfr依賴性和譜系可塑性之間存在複雜的相互作用。為了更好地闡明這些免疫介質的作用，前瞻性研究正在進行中。免疫檢查點抑制，包括聯合抗pd-1和抗-4治療，在ki耐藥環境下的臨床試驗中顯示明顯缺乏療效。除了正在努力評估腺苷軸的免疫抑制靶點，如腺苷2a受體(a2ar)、cd39和cd73，未來臨床試驗的合理靶點可能包括ido、dsc耗竭策略，如貝伐單抗或選擇性抑制pi3k-γ。
